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深入蛋白純化實(shí)驗(yàn)

更新時(shí)間:2017-01-17      瀏覽次數(shù):2127

   固定化金屬親和層析(IMAC)是蛋白純化的常用方法,特別適用于純化多組氨酸(His)標(biāo)簽融合蛋白。金屬離子通過(guò)螯合劑(配體)固定到基質(zhì)上,與多組氨酸標(biāo)簽相互作用,有效的螯合樣品中的融合蛋白。氮川三乙酸(NTA)和亞氨基二乙酸(IDA)是商業(yè)化樹(shù)脂中經(jīng)常使用的螯合配基。怎樣選擇合適的配基和金屬離子,應(yīng)用于蛋白純化實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/span>

首先,我們比較一下NTA和IDA。NTA是4價(jià)結(jié)構(gòu),IDA是3價(jià)結(jié)構(gòu),NTA比IDA多一個(gè)羧甲基。結(jié)構(gòu)上的不同,使得NTA比IDA更穩(wěn)定,能得到更高純度的目標(biāo)蛋白。IDA更小,使得它與基質(zhì)更緊密的結(jié)合,提高了載量,但同時(shí)也導(dǎo)致了更多的非目標(biāo)蛋白的結(jié)合,但I(xiàn)DA相對(duì)便宜。

  一些還原劑會(huì)影響IDA、NTA的性能。比如DTT會(huì)使金屬離子從IMAC 樹(shù)脂上剝落,常常會(huì)使樹(shù)脂的顏色變?yōu)樽厣籈DTA對(duì)配基的影響更大。但實(shí)驗(yàn)顯示,NTA耐受各類(lèi)化學(xué)試劑的能力明顯優(yōu)于IDA。

總結(jié)起來(lái),選用IMAC純化蛋白前,得先問(wèn)這幾個(gè)問(wèn)題:

1.蛋白純度、蛋白載量,哪個(gè)是你的目標(biāo)?

2.你的樣本中是否包含一些還原試劑如DTT或EDTA?

3.你的預(yù)算是?

   如果你只是想得到高的蛋白產(chǎn)量,對(duì)純度的要求稍微低點(diǎn),IDA結(jié)合的樹(shù)脂可能是你正確的選擇。如果想限度的減少非特異性結(jié)合,可以使用Zn2+ 或Co2+結(jié)合樹(shù)脂。從各類(lèi)數(shù)據(jù)來(lái)看,NTA結(jié)合樹(shù)脂都表現(xiàn)出極大的*性。而Ni-NTA樹(shù)脂則相當(dāng)于His標(biāo)簽蛋白純化的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)!

  不同的樣本或許純化的條件不盡相同,但以上zui基本的原則不同樣本都是適用的。

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